雙抗夾心ELISA法是指講特異性針對代測抗原的抗體包被于96孔微孔板中，制成固體載體，向微孔中分別加入標(biāo)準品或標(biāo)本，其中代測抗原連接于固相載體的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的針對代測抗原的抗體，形成夾心，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下，轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測抗體原正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），用于樣本中待測抗原濃度測算。

1.材料與儀器

（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）

（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）

（3）稀釋液

（4）終止液（2 M H2SO4）

（5）底物緩沖液 （pH 5.0）

（6）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使用液

（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液

（8）抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體：按說明書處理。

（9）標(biāo)準品：用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。

（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標(biāo)板）。

2.步驟

⑴將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

⑵加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

⑶加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

⑷加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。

根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。